PUREfrex®2.1于2017年推出，与2.0的版本相比，PUREfrex®2.1可以选择不同的还原剂，同时保留PUREfrex ®2.0反应溶液的成分，可根据需求选择更合适的蛋白合成条件。
二硫键的形成对于分泌蛋白如酶或抗体的折叠和稳定性具有重要的作用。二硫键通常由相邻半胱氨酸残基的巯基(SH-)氧化形成。因此，二硫键的形成效率取决于氧化还原状态。此外，能够催化二硫键交换的二硫键异构酶也是正确配对半胱氨酸所必需的。
PUREfrex®反应混合物中的氧化还原状态受还原剂类型以及还原剂和氧化剂比例的影响。PUREfrex 2.0的溶液I中含有二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂。PUREfrex 2.1的溶液I中不含还原剂，您可以为自己感兴趣的蛋白质选择合适的还原剂。PUREfrex 2.1的溶液I中既没有DTT也没有半胱氨酸。半胱氨酸、DTT和还原型谷胱甘肽(GSH)分别独立包装提供。您也可以根据实验需求使用其他还原剂，例如2-巯基乙醇（未提供）。
图2.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分对比
PUREfrex®2.1使用方法：
以20ul反应体系为例，如果需要扩大体积可以等比例增加对应试剂。以下是合成含有二硫键的蛋白质的标准方案，合成含有二硫键的蛋白需要搭配DsbC Set（该套装包含GSSG 和 DsbC），合成没有二硫键的蛋白时，用DTT来代替GSH，不需要使用DsbC Set。
1. 将溶液I，Cysteine, GSH和 GSSG在室温或37℃下加热1分钟至完全融解，然后在冰上冷却。
2. 在冰上融化溶液II，溶液III和DsbC。
3. 将每种溶液涡旋后离心收集管底内容物。
4. 根据下列表格配置反应液，每1kb加入模板DNA 1-3ng/ul。（注意:在PUREfrex® 2.1中，可以自由调节还原剂(例如：Cysteine、DTT和GSH)等的量，但是一定要加Cysteine，Cysteine是合成蛋白质的原料。）
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Water |
5-X μL |
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Solution I |
8μL *1 |
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10 mM Cysteine *2 |
1μL |
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80 mM GSH *2 |
1μL |
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60 mM GSSG |
1μL |
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Solution II |
1μL |
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Solution III |
2μL |
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80 µM DsbC *3 |
1μL |
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Template DNA *4 |
X μL |
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总体积 |
20ul |
5. 在37°C的heat block或水浴中反应 2~6 h，合成蛋白。注意：蛋白质合成反应通常最长到6小时，但是一些蛋白质需要更长的孵育时间(例如24小时)以在正确的半胱氨酸残基对之间形成二硫键。
6. 分析合成蛋白。
注释：*1. 使用量与PUREfrex ® 2.0 不同。
*2. 可以自由调节还原剂（半胱氨酸、DTT和GSH等）的量，但一定要添加半胱氨酸。
*3. 使用DsbC Set中包含的稀释缓冲液稀释DsbC。
*4. 模板DNA的制备请参考：https://purefrex.genefrontier.com/resources/tech_notes/template-dna-preparation.html/
试剂盒组分（各溶液成分保密）：
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组分名称 |
250 μL规格 |
2 mL x 5规格 |
组分内容 |
保存温度 |
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Solution I |
100 μL |
800 μL x 5 |
Amino acids, NTPs, tRNAs and substrates for enzymes etc. |
-20℃ |
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Solution II |
12.5 μL |
100 μL x 5 |
Proteins in 30 % glycerol buffer |
-20℃/-80℃ |
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Solution III |
25 μL |
200 μL x 5 |
Ribosome (20 μM) |
-80℃ |
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Cysteine |
20 μL |
160 μL x 5 |
Cysteine (10 mM) |
-20℃ |
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DTT |
20 μL |
160 μL x 5 |
Dithiothreitol (40 mM) |
-20℃ |
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GSH |
20 μL |
160 μL x 5 |
Reduced glutathione (80 mM) |
-20℃ |
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DHFR DNA |
10 μL |
10 μL x 1 |
PCR product containing a gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR) from E.coli as a positive control. (20 ng/μL) |
-20℃ |
请注意：1.上表中的保存温度为试剂盒开封后的保存温度，打开试剂盒之前请将试剂盒储存在-80℃的温度下。2.剩余的反应溶液储存在-80℃前使用液氮或干冰/乙醇等进行速冻。请根据需求进行分装，避免反复冻融。3. 合成DHFR时，请在20 µL合成反应溶液中添加1 µL DHFR DNA。
产品信息：
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货号 |
名称 |
规格 |
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GFK-PF213-0.25-EX |
PUREfrex®2.1 |
1 x 250 µl |
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GFK-PF213-2ML-EX |
2ml |
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GFK-PF213-10ML-EX |
5 x 2 ml |
当您的蛋白质需要分子伴侣的帮助或形成二硫键以形成正确的构象时，只需向PUREfrex®2.1中添加补充试剂即可。
分子伴侣-帮助蛋白正确折叠，合成可溶形式蛋白质
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产品货号 |
产品名称 |
规格 |
|
GFK-PF003-0.5-EX |
DnaK Mix |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF003-10ML-EX |
DnaK Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
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GFK-PF004-0.5-EX |
GroE Mix |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF004-10ML-EX |
GroE Mix |
5 x 2 ml Equivalents |
帮助形成二硫键的添加物
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产品货号 |
产品名称 |
规格 |
|
GFK-PF005-0.5-EX |
DsbC Set |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF005-10ML-EX |
DsbC Set |
5 x 2 ml Equivalents |
|
GFK-PF006-0.5-EX |
PDI Set |
500 µl Equivalents |
|
GFK-PF006-10ML-EX |
PDI Set |
5 x 2 ml Equivalents |
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